原代心肌细胞研究要注意些什么？

　　作为主要的研究模型，原代心肌细胞被广泛应用于心血管研究。那么我们在研究过程中都要注意些什么呢？

　　1、新生鼠年龄的选择新生鼠心肌细胞在出生后3天内具有部分增殖能力，而成年鼠心肌细胞为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生时间越短，离体心肌细胞存活率越高，越容易贴壁。大量观察表明，选择1～3日龄大鼠分离心肌细胞进行原代培养是理想的，尤其是半日龄大鼠。

　　2、消化酶的选择和使用

　　新生大鼠原代心肌细胞间可采用组织块法和消化法分离。前者较少使用，因为难以获得密度均匀的细胞和控制成纤维细胞的生长。消化法中常用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或II和透明质酸酶。透明质酸酶主要与胰蛋白酶或胶原酶结合使用。胰蛋白酶作用强，容易对心肌细胞造成损伤。胶原酶作用温和，能消化细胞间质中的胶原纤维，释放细胞，对细胞损伤小。在新生大鼠的心肌组织中，胶原酶Ⅰ主要是胶原Ⅰ。文献报道胶原酶的工作浓度一般为0.6～1G·L1，我们采用0.8g·L1。现在最好用胶原酶。

　　3、掌握消化程度

　　新生大鼠心肌细胞对酶消化非常敏感，过度消化会导致肌原纤维，增加细胞死亡率或失去粘附和搏动性；由于消化不充分，细胞聚集成簇，难以区分细胞边界和形态观察。在消解过程中使用磁力搅拌器时，应注意1）转速一般控制在60～80R·Min1左右。(2)每次消化的时间必须结合消化酶的浓度来确定。(3)吹走粘附在搅拌器上的心肌组织，使酶液充分接触组织。(4)适宜的温度为35～37℃(5)当组织由红变白并呈半透明状时，应停止消化。

　　4、接种细胞密度

　　原代心肌细胞间的接种密度不仅影响细胞间的相互接触，从而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的存活率。应准确计算接种细胞的绝对数。一般来说，单位面积的细胞数应根据实验的观察目的来确定。