GST pull down实验技术

GST Pull down实验技术

1. 实验原理

Pull down技术是将"诱饵"蛋白与一种易于纯化的配体标签（如：GST标签、His标签）进行融合表达，而带标签的诱饵蛋白能被特异结合该标签的固相亲和配基捕获，形成"次级亲和支持物"，用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。纯化产物洗脱后，经Western blot验证或LC-MS/MS，即鉴定与诱饵蛋白互作的蛋白。1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此，GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。GST融合蛋白在经过固定有谷胱甘肽（GSH）的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可以得到能够与“诱饵"蛋白相互作用的兴趣蛋白。GST pull down是一种体外验证或筛选互作蛋白的技术。

2. 实验流程

1. 构建带标签的诱饵蛋白原核表达载体（带GST标签或His或）；

2. 载体转化大肠杆菌，表达诱饵蛋白（关键步骤，很多蛋白原核表达时会形成包涵体，极大地影响后续实验。我们采用自诱导培养基培养细菌，能有效降低包涵体的形成）；

3. 细菌裂解液过柱子，带标签的诱饵蛋白被特异结合标签的固相化亲和配基捕获，产生"次级亲和支持物"；

4. 待测样品裂解液过柱子孵育，与诱饵蛋白互作的蛋白被“次级亲和支持物"吸附；

5. 清洗，离心，去除未结合的杂蛋白；

6. 洗脱，得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物；

7. 如要验证某个蛋白X与诱饵蛋白互作，则将6.所得的蛋白复合物与X蛋白的抗体孵育，做Western blot验证；

8. 如要寻找诱饵蛋白可能的互作蛋白，则将6.所得的蛋白复合物进行LC-MS/MS鉴定。

3. 技术服务

1. 原核表达载体构建；

2. 融合蛋白的诱导表达和纯化；

3. pull down捕获互作蛋白；

4. Western blot验证（两种目标蛋白互作/两种蛋白互作的结构域）；

5. LC-MS/MS鉴定可能的互作蛋白。

4. 交付结果

1. 客观公正的实验原始数据和分析结果；

2. 提供详细、完整的实验报告。

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