新生SD大鼠大脑皮层神经元原代分离培养方法

一. 实验方法

1. 多聚赖氨酸（Poly-D-Lysine）包被培养板的制备：原代分离进行前一天，用PBS缓冲液配制终浓度为0.1mg/ml的多聚赖氨酸工作液，0.22μm滤膜过滤除菌，于超净工作台内吸取1ml加入六孔板内，确保覆盖板底，静置孵育30min后吸出（可回收反复使用2-3次），用无菌水清洗培养板，置于超净台内晾干，照紫外过夜。

2. 次日，取出生24h以内的SD大鼠，75%乙醇浸泡消毒5min。

3. 棉球吸干乳鼠体表的乙醇，迅速断头，浸泡于冰冷的含有2%双抗的PBS缓冲液中。

4. 剪开颅骨，取出脑，转移至新的培养皿中，逐个剥离大脑皮层并浸泡于冰冷的含有2%双抗的D-HANKS液中。

5. 将剥离的皮层清洗两遍，弃去液体，用眼科剪迅速将皮层剪碎至糜状。

6. 加入2倍体积的木瓜酶（使用前用PBS稀释至终浓度2mg/ml），放入37℃培养箱内消化20min，期间用移液管吹打1-2次使之分散。

7. 消化结束后，加入10倍体积的D-HANKS液，同时加入1mg/ml的DNA酶，吹打混匀。

8. 用100μm孔径的细胞筛过滤悬液一次，移至新的15ml离心管内，1000rpm离心5min。

9. 弃去上清，D-HANKS液重悬细胞，吹打使之分散，并用70μm细胞筛过滤一遍，转移至新的离心管，再次1000rpm离心5min。

10. 弃去上清，用含有1%GLUT-MAX和2% B-27的Neurobasl-A培养基重悬细胞，调整浓度为3×10⁵/ml铺于多聚赖氨酸包被的六孔板中，37℃ 5%CO²培养箱内培养。

11. 4h后换液，弃去培养基和未贴壁细胞，并用PBS轻轻冲洗一遍，加入新鲜的含有1%GLUT-MAX和2% B-27的Neurobasl-A培养基继续培养，后续没3天换液。

12. 一周后神经元*展开，可用于后续试验。

二. 结果与分析

1. 取材&分离

2. 细胞培养