细胞冻存和复苏实验

实验方法原理：

       细胞冻存和复苏的基本原理是慢冻快解冻，已被证明能最大限度地提高细胞活力。目前常用甘油或二甲基亚砜作为细胞低温保存的保护剂。这两种物质可以提高细胞膜对水的渗透性，再加上缓慢的冷冻可以使细胞内的水从细胞中渗出，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶形成对细胞的损伤。复苏细胞时应采用快速熔融的方法，以保证细胞外晶体在短时间内熔融，以避免因水缓慢熔融进入细胞形成细胞内重结晶而对细胞造成损伤。

实验材料：细胞

试剂、试剂盒：

       D-Hanks液 、小牛血清 、培养液、 青霉素、 链霉素、 胰蛋白酶、 HCl 、NaHCO3、 DMSO、 甘油

仪器、耗材：

微量加样枪、吸头、 离心管、 冻存管 、枪头、 胶塞 、移液管玻璃瓶、 红血球计数板、 记号笔、 医用橡皮膏 、移液枪 、超净工作台 、离心机 、恒温水浴箱、 冰箱、 倒置相差显微镜 、培养箱 、液氮冰箱

实验步骤：

1、细胞冻存

①10%DMSO或甘油冷冻培养基的制备10～20%小牛血清。

② 对数生长期细胞用胰蛋白酶消化，悬液中生长的细胞直接移到15 ml离心管。

③离心机转速1000转，5分钟。

④除去胰蛋白酶和旧培养基，加入适量配制好的冷冻培养基。用吸管轻轻吹气使细胞均匀、计数，调整冻液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。

⑤细胞分成深低温保存管，每管1～1.5ml。

⑥低温保存管上标明细胞名称、冷冻时间和操作人员。

⑦冷冻：标准的冷冻程序是冷却速度为-1～-2°C/min。温度低于-25℃时，可提高到-5°C~-10°C / min.。在-100℃时，可快速浸入液氮中。含有细胞的冷冻保存管也可以放在-20°C的冰箱里1189个小时，然后放入-70°D的冰箱中过夜。取出冷冻管并将其移到液氮容器中。

2、细胞复苏：

①将冷冻管从液氮容器中取出，直接浸入37°C温水中，并不时摇晃，使其尽快融化。

②从37°C水浴中取出冻存管，打开盖子，用移液器吸出细胞悬液，加入离心管滴下培养液10倍以上，搅拌均匀。       

③离心，1000转/分钟，5分钟。

④弃去上清液，加入10%小牛血清培养基悬浮细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37°C培养箱培养。

⑤第二天更换培养基，继续培养。

注册事项：

①从增殖期到形成致密单层细胞的培养细胞可用于低温保存，但优选对数生长期细胞。冷冻前一天最好换培养基。

②将冷冻储存管放入液氮容器或取出时，要做好防护工作，避免冻伤。。

③冷冻复苏时，最好使用新配制的培养基。