细胞培养基

一、常用的细胞培养基介绍

1. BME培养基，基础 Eagle 培养基（basal medium eagle)

BME培养基是一种广泛使用的合成基础培养基，可支持很多种类的哺乳动物细胞生长。BME 最初由 Harry Eagle 针对 HeLa 细胞和小鼠成纤维细胞开发，其发现了体外细胞生长的zui 低要求。BME 不含蛋白、脂类或生长因子。因此，BME 需要添加剂。

2. MEM培养基（Minimum Eagle's Medium）

MEM培养基是所有培养基中zui常用的一种，可用于多种悬浮和贴壁生长的哺乳动物细胞，包括 HeLa、BHK-21、293、HEP-2、HT-1080、MCF-7、成纤维细胞和原代大鼠星形胶质细胞。

3. DMEM培养基，Dulbecco 改良 Eagle 培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）

DMEM培养基是一种广泛使用的基础培养基，可用于支持很多种类的哺乳动物细胞生长。已经在 DMEM 中培养成功的细胞包括原代成纤维细胞、神经元、胶质细胞、HUVEC、平滑肌细胞，以及 HeLa、293、Cos-7 和 PC-12 等细胞系。

4. IMDM培养基（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）

IMDM培养基是一种高度富集的合成培养基，非常适用于快速增殖的高密度细胞培养，包括 Jurkat、COS-7 和巨噬细胞。

5. RPMI-1640培养基（Roswell Park Memorial Institute 1640）

RPMI-1640 培养基被发现适用于多种哺乳动物细胞，包括 HeLa 细胞、Jurkat 细胞、 MCF-7 细胞、PC12 细胞、PBMC 细胞、星形胶质细胞和癌细胞。RPMI 1640 培养基相比其他培养基之所以具有*的效果，是因为其中含有还原剂谷胱甘肽和高浓度的维生素。RPMI 1640 培养基含有生物素、 维生素 B12 以及 PABA，这些成分是 Eagle’s MEM 和DMEM所不具备的。

6. M199培养基（Medium 199）

199 培养基最初配方用于鸡胚成纤维细胞的营养研究。199 培养基由 Earle’s 平衡盐或 Hanks’ 平衡盐配制而成。由 Earle’s 平衡盐配制而成的培养基使用碳酸氢盐/碳酸系统缓冲液，并在 CO2培养箱中保持 pH 值。 在大气条件下使用 Earle’s 平衡盐会导致培养基 pH 值迅速升高。由 Hanks’ 平衡盐配制而成的 199 培养基使用专为大气平衡设计的专用盐溶液进行缓冲，在CO2 培养箱中使用会令培养基 pH 值迅速下降。

7. McCoy's 5A（改良）培养基（McCoy's 5A (Modified) Medium）

McCoy's 5 A （改良）培养基是一种通用培养基，可支持多种类型原代细胞、成熟细胞系以及活检组织块的增殖。这种培养基可支持源自正常骨髓、皮肤、脾脏、肾脏、肺、大鼠胚胎及其他组织的原代哺乳动物细胞的生长。Thomas McCoy 博士起初将 McCoy's5 A 培养基配制为基础培养基 5 A 的改良版本。与其他培养基不同，McCoy's5 A 包含还原剂谷胱甘肽、细菌蛋白胨和高浓度葡萄糖。McCoy's 5A（改良）培养基使用碳酸氢钠缓冲体系 (2.2 g/L)，因此需要 5–10% CO2 的环境来维持生理 pH 值。

8. Ham's F-12营养培养基

Ham's F-12 营养混合物 (F-12) 起初设计用于中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞的无血清单细胞铺板。自此之后，F-12 已用于 CHO 培养物的无血清生长以及其他哺乳动物细胞的添加血清生长，包括软骨细胞和大鼠前列腺上皮细胞。与其他基础培养基相比，F-12 含有更广泛的成分，包括锌、腐胺、Hypoxanthine和胸苷。CHO 细胞在 F-12 中的无血清生长催生了各种改良配方。

9. Leibovitz L15培养基

Leibovitz L-15 培养基支持 HEP-2 猴肾脏细胞以及胚胎和成人组织的原代组织块生长。L-15 采用磷酸盐和游离氨基酸而非碳酸氢钠进行缓冲。这种培养基适用于支持非 CO2 平衡环境中的细胞生长。L-15 不含蛋白、脂质或生长因子。

10. Neurobasal培养基

Neurobasal 培养基是一种基础培养基，设计用于纯产前和胚胎神经元细胞群的长期维持和成熟，在与 Gibco B-27 补充剂配合使用时无需星形胶质细胞滋养层。Neurobasal 培养基适用于大多数神经元细胞应用。

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二、常用的细胞培养基配套试剂(缓冲液、平衡盐溶液等)

1、无钙、镁、离子溶液(1000ml)

氯化钠(NaCl)8g磷酸二氢钠、(NaH2PO4H20)0.05g、Potassium chloride (KCl)0.2g、碳酸氢钠(NaHCO3)1g、柠檬酸三钠(Na3C6H5O7,H20)1g、葡萄糖1g、加去离子水或双蒸水至1000mL

2、PBS(Phosphate-Buffered saline)磷酸盐缓冲液

甲液:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液、磷酸氢二钠(无水)28.4g、氯化钠8.77g加去离子水或双蒸水至1000mL

乙液:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液、磷酸二氢钠(无水)2.4g、氯化钠8.77g加去离子水或双蒸水至1000mL

甲、乙液于4℃保存，使用时按表3-2所示比例，配制成所需pH浓度，高压灭菌后室温保存。

3、Hanks液(HBSSHank's Balanced salt solution)

⑴母液甲(20x)配法

①NaCl(A.R)160g、KCl(A.R)8g、MgSO4.7H2O(A.R)2g、MgCl.6H2O(A.R)2g依次溶于800mL双蒸水中，前一物质溶后再加后一种。

②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL双蒸水中，溶时不断搅拌(此液应单配，单溶)。

待上述两溶液中的"溶质"全溶后，将它们混合，再用双蒸水补至1000mL，向其中加2mL氯仿作为防腐剂，置4℃保存。

⑵母液乙(20×)配法

①Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g、KH2PO4(A.R)1.20g、葡萄糖(A.R)20.0g溶于800ml双蒸水中。

②0.4%酚红液0.4g酚红放在玻璃研钵后加0.01N、NaOH11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，过滤，pH为7.4，4℃保存。

待上述各"溶质"*溶解后，用双蒸水补至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐剂，置40℃保存。

3)使用液(1×)配法

取母液甲和母液乙各一份，加双蒸水18份，分装后，塞好瓶塞，挂上标志。以115℃高压灭菌25分钟(以免葡萄糖破坏)，置室温后4℃保存，可使用几个月。临用前，用7.5%NaHCO3调至所需pH。

4、Eagle's液(EBSSEagle's Balanced salt solution)

是一种在二氧化碳(CO2)环境中短期维持细胞活性的平衡盐溶液，可用于细胞解离前的清洗、细胞或组织的运输、细胞计数时稀释、溶液的配置等。

5、HEPES液

生物缓冲液，化学性质稳定，在PH7.2~7.6范围内，比NaHCO3缓冲液的缓冲能力更强。

6、NaHCO3缓冲液

常规缓冲体系的一部分，但是不稳定，易受空气中CO2的含量而改变PH值，影响缓冲效果。

三、相关细胞培养知识

细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。细胞培养是指从动物活体体内取出组织，于模拟体内生理环境等特定的体内条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。细胞培养现已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。细胞的生长需要营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。

根据细胞生长的恃点，需要选择不同方法进行细胞传代：

◆ 贴壁生长的细胞用消化法传代；

◆ 部分贴壁生长（半悬浮生长）的细胞用直接吹打可传代；

◆ 悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。

1.  贴壁细胞的消化法传代：

1）先吸除或倒掉瓶内旧培养液。

2）D-Hanks液洗2～3次。

3）向瓶内加入适量消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。（注意：胰蛋白酶要预温，温度37℃左右为宜。）

4）消化最好在37℃环境下进行，消化2～5 min 后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化。

5）吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉，再添加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。

6）用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞。从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，不要用力过猛。

7） 细胞计数后分别接种在新的培养瓶内。

8）置于37℃细胞培养箱培养。（注意：要定时观察细胞，如发现污染，应及时处理。）

2.  悬浮细胞的传代：悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代，或直接传代。

离心传代法：

1） 将细胞连同培养液一并转移到15 ml 离心管内。

2） 800~1000 rpm离心5 min。（注意：离心转速要合适。转速过低，不能有效分离细胞；离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。）

3） 弃去上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液。

4） 计数，分别接种在新的培养瓶内。

直接传代法：让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。

3.  部分贴壁细胞的传代

1）部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等，不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。

2）对绝大部分贴壁生长的细胞，因直接吹打对细胞损伤较大，细胞常有较大数量的丢失，因而需消化后，才能吹打传代。