细胞培养

一、产品介绍

细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。细胞的生长需要营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。

细胞培养是指从动物活体体内取出组织，于模拟体内生理环境等特定的体内条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。细胞培养现已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域。

二、过程介绍

细胞培养过程中，涉及到多个基本实验操作，例如：复苏、换液、传代、冻存等。

复苏

1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动(注意防止盖子不紧致使液体进入冻存管)。液体都融化后(大概1-1.5分钟)，拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

2.把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来)，1000转离心5分钟。

3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到37℃的5%CO2培养箱中培养。

5.根据细胞增长速度2-3天换一次培养基。

换液（以贴壁细胞为例）

1.培养一段时间后，细胞还未长满，而细胞培养基颜色由红色逐渐变黄，说明培养基中营养物质不足，需要及时换液。

2.吸掉原有培养基。

3.加入等体积新的*培养基。

4.放到37℃的5%CO2培养箱中继续培养。

5.培养过程中，要定期观察细胞状态。如果细胞密度达到80%-90%需要准备传代。

传代（以贴壁细胞为例）

1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

2.把原有培养基吸掉。

3.加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行)，消化1-2分钟。

4.细胞都变圆后加入等体积的含血清的培养基终止消化。

5.用移液枪吹打细胞，让细胞悬浮起来。

6.把细胞吸到10ml或15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

7.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。

8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中，一般1: 2~3传代。

冻存

把细胞消化下来并离心(同上)。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃ 过夜，然后放到液氮灌中保存。

冻存液的配制:80%的*培养基+10�S+10%DMSO。注意：DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

三、根据细胞生长的恃点，需要选择不同方法进行细胞传代

◆ 贴壁生长的细胞用消化法传代；

◆ 部分贴壁生长（半悬浮生长）的细胞用直接吹打可传代；

◆ 悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。

1.  贴壁细胞的消化法传代：

1）先吸除或倒掉瓶内旧培养液。

2）D-Hanks液洗2～3次。

3）向瓶内加入适量消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。（注意：胰蛋白酶要预温，温度37℃左右为宜。）

4）消化最好在37℃环境下进行，消化2～5 min 后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化。

5）吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉，再添加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。

6）用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞。从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，不要用力过猛。

7） 细胞计数后分别接种在新的培养瓶内。

8）置于37℃细胞培养箱培养。（注意：要定时观察细胞，如发现污染，应及时处理。）

2.  悬浮细胞的传代：悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代，或直接传代。

离心传代法：

1） 将细胞连同培养液一并转移到15 ml 离心管内。

2） 800~1000 rpm离心5 min。（注意：离心转速要合适。转速过低，不能有效分离细胞；离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。）

3） 弃去上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液。

4） 计数，分别接种在新的培养瓶内。

直接传代法：让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。

3.  部分贴壁细胞的传代

1）部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等，不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。

2）对绝大部分贴壁生长的细胞，因直接吹打对细胞损伤较大，细胞常有较大数量的丢失，因而需消化后，才能吹打传代。

四、细胞培养优缺点

优点：

1）能长期传代，保持活性，便于监控检测结构功能和生命活动。

2）培养条件可以人为的控制便于研究细胞代谢、物理、化学、生物因素的影响

3）可用于各种观察和检测手段研究活细胞的变化(变异、分化)。可从细胞水平开展亚细胞结构和代谢分子的表达。

4）研究范围和细胞来源广泛，选择性广。

5）不同代次细胞可长期保存，既可开展同代次不同条件和方法研究，又可观察不同代次的动态变化。

6）耗资少、经济、成本低、可大量培养，利于生物制品的生产。

缺点：

细胞或组织生长在人工环境中，与体内环境存在差异，细胞或组织的形态或功能会发生不同程度的改变。